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在 DNA 凝胶上验证 CRISPR–Cas9 切割
让未切割质粒与 Cas9 酶切的 DNA 跑琼脂糖凝胶：切割后一条带变成两条。
目标
以分子量标准读取条带位置，把片段大小与 Cas9 切点对应，并识别失败或部分切割。
仪器与试剂
琼脂糖凝胶、TBE 缓冲液、DNA 分子量标准、质粒 DNA（约 5 kb）、Cas9–gRNA 核糖核蛋白、DNA 染料（如 GelRed）、电源、透射仪。
步骤
- 加入未切割质粒样品，记下加样孔附近的单条带。
- 切换到 Cas9 + gRNA 酶切样品并比较：一次双链断裂产生迁移率不同的两个片段，出现两条带。
- 以分子量标准测量各条带：5 kb 质粒被切一次，若 gRNA 位于全长 3/5 处，应得约 3 kb + 约 2 kb。
- 观察经 NHEJ 修复的泳道：几个碱基对的 indel 几乎不移动条带——必须靠测序才能看到。
观察要点
- 未切割环状质粒停留在加样孔附近高处；线性化/切割的 DNA 迁移，较短的 2 kb 片段跑在 3 kb 之前。
- 标准泳道提供参考大小；把条带位置与其对照即可把迁移距离换算成千碱基估计值。
讲解
琼脂糖是一张网：电场把带负电的 DNA 拉向阳极，短片段穿网孔更快，迁移距离约随 log₁₀(大小) 递减。Cas9–gRNA 结合 PAM 旁的 20 nt 前间隔序列，在其上游约 3 nt 处造成平末端双链断裂；5 kb 质粒被切一次产生两个片段，其大小即可定位切点。细胞内经 NHEJ 修复后，小 indel 只改变几个碱基对，在 1% 凝胶上看不出来，因此需测序或 T7E1 实验确认编辑。
实验史话
蒂塞利乌斯因移动界面电泳获 1948 年诺贝尔奖，DNA 凝胶电泳在 20 世纪 70 年代普及。Jinek、Charpentier 和 Doudna 于 2012 年证明可用向导 RNA 编程 Cas9 切割任何匹配的 DNA。凝胶切割实验至今仍是检验编辑的第一步。
相关化学家
虚拟实验是帮助建立直觉的简化模型，不能替代真实实验和安全培训；没有指导请勿在家自行重复。