Vérifier une coupure CRISPR–Cas9 sur gel d’ADN
Faire migrer un plasmide intact et de l’ADN digéré par Cas9 sur gel d’agarose : une bande devient deux après coupure.
Objectif
Lire les positions des bandes face à l’échelle, relier les tailles des fragments au site de coupure de Cas9, et repérer une coupure ratée ou partielle.
Matériel et réactifs
Gel d’agarose, tampon TBE, échelle d’ADN, ADN plasmide (~5 kb), ribonucléoprotéine Cas9–gRNA, colorant d’ADN (p. ex. GelRed), alimentation, transilluminateur.
Procédure
- Déposer le plasmide intact et noter sa bande unique près du puits.
- Passer au digest Cas9 + gRNA et comparer : deux bandes apparaissent car une cassure double brin génère deux fragments de mobilité différente.
- Mesurer chaque bande sur l’échelle : un plasmide de 5 kb coupé une fois donne ~3 kb + ~2 kb si le guide se situe aux 3/5 de la longueur.
- Observer la piste réparée par NHEJ : des indels de quelques paires de bases déplacent à peine les bandes — il faut séquencer pour les voir.
À observer
- Le plasmide circulaire intact reste haut près du puits ; l’ADN linéarisé/coupé migre, et le fragment de 2 kb devance celui de 3 kb.
- La piste d’échelle fournit des tailles de référence ; comparer la hauteur des bandes convertit les distances en estimations en kilobases.
Explication
L’agarose est un maillage : le champ électrique entraîne l’ADN négatif vers l’anode, et les fragments courts passent les pores plus vite — la distance de migration décroît à peu près avec log₁₀(taille). Cas9–gRNA se lie au protospacer de 20 nt adjacent à un PAM et crée une cassure double brin franche ~3 nt en amont ; une coupure dans un plasmide de 5 kb donne deux fragments dont les tailles localisent le site. Après réparation NHEJ cellulaire, les petits indels ne changent la taille que de quelques paires de bases — invisibles sur gel à 1 % ; un séquençage ou un test T7E1 confirme l’édition.
Histoire de l’expérience
Chimistes associés
Expérience virtuelle : un modèle simplifié pour construire l’intuition. Elle ne remplace ni le travail réel en laboratoire ni la formation à la sécurité ; ne la reproduisez pas chez vous sans encadrement.