Kiểm chứng vết cắt CRISPR–Cas9 trên gel DNA
Chạy điện di plasmid chưa cắt và DNA đã tiêu hóa bằng Cas9 trên gel agarose: một vạch trở thành hai vạch sau khi cắt.
Mục tiêu
Đọc vị trí vạch so với thang chuẩn, liên hệ kích thước đoạn với vị trí cắt của Cas9, và nhận biết vết cắt hỏng hoặc không hoàn toàn.
Dụng cụ và hoá chất
Gel agarose, đệm TBE, thang DNA, DNA plasmid (~5 kb), phức Cas9–gRNA, thuốc nhuộm DNA (vd. GelRed), nguồn điện, đèn soi gel.
Cách làm
- Nạp mẫu plasmid chưa cắt và ghi nhận vạch đơn gần giếng.
- Chuyển sang mẫu tiêu hóa Cas9 + gRNA và so sánh: hai vạch xuất hiện vì một vết cắt đôi sợi làm phân tử tách thành hai đoạn có độ di chuyển khác nhau.
- Đo từng vạch theo thang chuẩn: plasmid 5 kb cắt một lần sẽ cho ~3 kb + ~2 kb nếu vị trí gRNA nằm ở 3/5 chiều dài.
- Nhìn làn đã sửa NHEJ: indel vài cặp bazơ hầu như không làm vạch dịch — cần giải trình tự mới thấy được.
Điều cần quan sát
- Plasmid vòng chưa cắt đứng cao gần giếng; DNA đã tuyến tính hoá/cắt di chuyển, và đoạn 2 kb ngắn hơn chạy trước đoạn 3 kb.
- Làn thang chuẩn cho các kích thước tham chiếu; đối chiếu độ cao vạch với nó chuyển khoảng cách thành ước lượng kilobase.
Giải thích
Agarose là một lưới: điện trường kéo DNA tích điện âm về cực dương, và đoạn ngắn chui qua lỗ lưới nhanh hơn, nên quãng đường di chuyển giảm gần như theo log₁₀(kích thước). Phức Cas9–gRNA bám vào đoạn protospacer 20 nt cạnh PAM và tạo vết cắt đôi sợi cùn ~3 nt trước PAM; một vết cắt trên plasmid 5 kb cho hai đoạn mà kích thước cho biết vị trí cắt. Sau sửa NHEJ trong tế bào, indel nhỏ chỉ đổi kích thước vài cặp bazơ — vô hình trên gel 1%, nên phải giải trình tự hoặc dùng thử T7E1 để xác nhận chỉnh sửa.
Lịch sử thí nghiệm
Nhà hoá học liên quan
Chủ đề liên quan
Thí nghiệm ảo: một mô hình đơn giản hoá để xây dựng trực giác. Nó không thay thế thực hành thật và huấn luyện an toàn; không tự làm lại tại nhà khi không có người hướng dẫn.