大学 · 25分
DNA ゲルで CRISPR–Cas9 の切断を検証
未切断プラスミドと Cas9 消化 DNA をアガロースゲルで泳動する：切断により 1 バンドが 2 バンドになる。
目的
ラダーを基準にバンド位置を読み取り、断片サイズを Cas9 切断部位に対応させ、切断失敗や不完全切断を見分ける。
器具と試薬
アガロースゲル、TBE 緩衝液、DNA ラダー、プラスミド DNA（約 5 kb）、Cas9–gRNA リボ核タンパク、DNA 染色（例：GelRed）、電源、トランスイルミネーター。
手順
- 未切断プラスミドを載せ、ウェル近くの単一バンドを確認する。
- Cas9 + gRNA 消化試料に切り替えて比較する。1 か所の二本鎖切断で移動度の異なる 2 断片が生じ、2 バンドが現れる。
- ラダーを基準に各バンドを測る。5 kb プラスミドが 1 か所切られると、gRNA が全長の 3/5 にあれば約 3 kb + 約 2 kb になる。
- NHEJ 修復レーンを見る：数塩基対の indel ではバンドはほとんどずれない。検出には配列決定が必要である。
観察すること
- 未切断の環状プラスミドはウェル近くの高い位置に残り、線状化・切断された DNA は泳動し、短い 2 kb 断片が 3 kb より先に進む。
- ラダーレーンが基準サイズを与え、バンド位置と照合することで泳動距離を kb 推定値に変換できる。
解説
アガロースは網目であり、電場は負に荷電した DNA を陽極へ引き、短い断片ほど網目を速く通り抜ける。泳動距離はおよそ log₁₀(サイズ) に反比例して減る。Cas9–gRNA は PAM に隣接する 20 nt のプロトスペーサーに結合し、その約 3 nt 上流に平滑二本鎖切断を入れる。5 kb プラスミドの 1 か所切断で、切断部位を示す 2 断片が得られる。細胞内の NHEJ 修復後、小さな indel は数塩基対しかサイズを変えず 1% ゲルでは見えないため、編集確認には配列決定や T7E1 アッセイを用いる。
実験の歴史
ティセリウスは1948年に移動境界電気泳動でノーベル賞を受賞し、DNA のゲル電気泳動は1970年代に定着した。2012年、ジネック、シャルパンティエ、ドウドナは Cas9 がガイド RNA で任意の相補 DNA を切断するようプログラムできることを示した。ゲル上の切断アッセイは今も編集の最初の簡易確認法である。
ゆかりの化学者
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バーチャル実験は直感をつかむための簡略化したモデルです。実際の実験や安全教育の代わりにはなりません。指導者なしに自宅で再現しないでください。