Đại học · 35 phút

Đo Michaelis–Menten: nhận dạng kiểu ức chế

Chạy các phép đo tốc độ ảo ở tám nồng độ cơ chất, rồi phân loại chất ức chế chưa biết qua cách Km và Vmax thay đổi — kỹ năng cốt lõi của động học enzyme.

Mục tiêu

Phân biệt ức chế cạnh tranh, không cạnh tranh và uncompetitive trên đường $v = V_\mathrm{max}[S]/(K_m^{\mathrm{app}} + [S])$ và dự đoán ảnh hưởng của từng kiểu lên đồ thị Lineweaver–Burk.

Dụng cụ và hoá chất

Phép đo ảo: dung dịch cơ chất gốc (0–8 mM), cùng một lô enzyme ( $V_\mathrm{max} = 10$ , $K_m = 1$ mM), và chất ức chế ở $[I]$ cố định; mô phỏng tái hiện các đường lý tưởng hoá.

Cách làm

Chọn “không có” và rê chuột tại $[S] = 1$ mM: kiểm tra $v = V_\mathrm{max}/2 = 5$ , đọc ra $K_m$ .
Chuyển sang ức chế cạnh tranh: nền bão hoà không đổi nhưng điểm bán bão hoà dịch phải — đo $K_m$ biểu kiến mới.
Chọn không cạnh tranh: giờ nền bão hoà tụt còn một nửa trong khi $K_m$ vẫn ở 1 mM.
Thử uncompetitive: cả $K_m^{\mathrm{app}}$ lẫn $V_\mathrm{max}^{\mathrm{app}}$ đều giảm một nửa — dấu hiệu hiếm khi ức chế cần phức ES.
Tự phác đồ thị 1/v theo 1/[S] cho từng trường hợp: các đường song song báo uncompetitive, cùng giao điểm trục tung báo cạnh tranh.

Điều cần quan sát

Cạnh tranh: $K_m^{\mathrm{app}}$ tăng còn $V_\mathrm{max}$ giữ nguyên — chất ức chế chỉ tranh enzyme tự do.
Không cạnh tranh: $V_\mathrm{max}^{\mathrm{app}}$ giảm nhưng $K_m$ giữ nguyên — chất ức chế gắn E và ES như nhau, loại bỏ enzyme hoạt động.
Uncompetitive: đường cong vừa thấp hơn vừa dốc hơn gần gốc — gắn vào ES lấy phức đi và kéo cân bằng tạo thêm ES.

Giải thích

Ba cơ chế kinh điển khác nhau ở chỗ chất ức chế gắn vào đâu: vào E (cạnh tranh, nên thêm cơ chất đẩy nó ra và $K_m^{\mathrm{app}} = K_m(1+[I]/K_i)$ ), vào cả E lẫn ES ngang nhau (không cạnh tranh, $V_\mathrm{max}^{\mathrm{app}} = V_\mathrm{max}/(1+[I]/K_i)$ ), hay chỉ vào ES (uncompetitive, chia cả hai hằng số cho $1+[I]/K_i$ ). Trên đồ thị nghịch đảo kép, chúng thành các đường cắt nhau ở trục tung, các đường song song, và các đường chung giao điểm trục hoành — đó là lý do đồ thị Lineweaver–Burk vẫn dạy cơ chế dù ngày nay khớp đường cong đã làm bằng phi tuyến.

Lịch sử thí nghiệm

Leonor Michaelis và Maud Menten công bố phương trình năm 1913 sau khi nghiên cứu invertase; Maud Menten — một trong những nữ bác sĩ đầu tiên của Canada — được vinh danh khi phương trình mang tên cả hai.

Nhà hoá học liên quan

Frances Arnold Emil Fischer

Chủ đề liên quan

Enzyme và động học enzyme Cơ chế phản ứng phức tạp, xúc tác

Thí nghiệm ảo: một mô hình đơn giản hoá để xây dựng trực giác. Nó không thay thế thực hành thật và huấn luyện an toàn; không tự làm lại tại nhà khi không có người hướng dẫn.